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                         通用型DNA純化回收試劑盒說明書

 Universal DNA Purification Kit

目錄號：  YJ0519

保   存：  室溫

組分說明

                                         Cat.No.                   YJ0519

                                          KitSize                     50

                                         BufferPC                   50ml

                                         BufferPS                   15ml

                                BufferPW（concentrate）                10ml

                                         BufferEB                   10ml

                                     SpinColumnDM                   50

                                 CollectionTube（2ml）                 50

產(chǎn)品簡介

   本試劑盒采用新型硅基質(zhì)膜及特殊的緩沖液系統(tǒng)，專一的結(jié)合 DNA，既能從瓊脂糖凝膠中回收 DNA 片段，又能直接純化 PCR  產(chǎn)物與酶反應(yīng)物中的單鏈、雙鏈 DNA，可zui大限度地去除引物、酶、礦物油、瓊脂糖等雜質(zhì)，獲得高純度的DNA，滿足多種實(shí)驗(yàn)要求。本試劑盒可回收 50bp-50kb 的 DNA 片段，每個(gè)吸附柱zui高可吸附 20 μg 的 DNA，且 DNA回收效率高達(dá) 90%。由本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用于酶切、連接、PCR 擴(kuò)增、DNA 測序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.  *次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在BufferPW中加入無水乙醇。

2.  使用前請檢查BufferPC是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在37℃水浴幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

3.  電泳時(shí)使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。

4.  切膠時(shí)，紫外照射時(shí)間應(yīng)盡量短，以免對DNA造成損傷。

5.  回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)。

6.  所有離心步驟均在室溫下進(jìn)行。

自備試劑：無水乙醇，離心管  

操作步驟

1． 樣品處理

   A 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

   a1. 將單一目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余凝膠部分），放入干凈的離心管（自備）中，稱取凝膠重量。 

        注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。

   a2. 向膠塊中加入3倍凝膠體積的Buffer PC；當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度>2%時(shí)，建議使用6倍凝膠體積的  Buffer PC（如凝膠重為100mg，其體積可視為100μl，依此類推）。

   a3.50℃孵育10分鐘，其間不斷溫和地上下顛倒離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊*溶解。

       注意：1）在膠充分溶解后檢測pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的膠溶液中加10-30μl 的3M醋酸鈉（pH5.0）將pH值調(diào)到5-7

             2）吸附柱的容積是 700μl，若樣品體積大于 700μl 可分批加入。

             3）膠塊*溶解后將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因?yàn)槲街谳^高溫度時(shí)結(jié)合 DNA 的能力較弱。

   a4.（可選步驟）當(dāng)回收片段<500bp或>4kb時(shí)，應(yīng)加入1倍膠體積的異丙醇，上下顛倒混勻（如凝膠為100mg，則加入100μl異丙醇）。

       注意：當(dāng)回收片段為500bp-4kb時(shí)，加入異丙醇不會影響回收率。

   B 從PCR反應(yīng)液或酶反應(yīng)液中回收DNA

   b1．計(jì)算PCR反應(yīng)液或酶切反應(yīng)液的體積，向其中加入5倍PCR反應(yīng)液或酶反應(yīng)液體積的 Buffer PC，充分混勻（無需去除石蠟油或礦物油）。

    例如：100 μl的PCR樣本中加入500μlBufferPC（不包括石蠟油或礦物油）。

2． 柱平衡: 將吸附柱（SpinColumnDM）放入收集管（CollectionTube）中，向吸附柱中加入200 μl Buffer PS，12,000 rpm（~13,400×g）離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

3． 將從a3或b1中所得溶液加入到平衡好的吸附柱（已裝入收集管）中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

    注意：吸附柱容積為700μl，若樣品體積大于700μl 可分批加入。

4． 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。

    注意：如果純化的DNA用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)（例如平末端連接或直接測序），建議加入BufferPW靜置2-5分鐘再離心。

5． 將吸附柱放回收集管中，12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以*晾干吸附材料中殘余的乙醇。

6.  將吸附柱放到一個(gè)新離心管（自備）中，向吸附膜中間位置加入30-50 μl Buffer EB（pH8.5）或水（pH7.0-8.5），室溫放置2分鐘。12,000rpm離心2分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

    注意：1）洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍）。

          2）為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，重復(fù)步驟6。

          3）洗脫體積不應(yīng)小于30μl，體積過少會影響回收效率。

          4）如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。

          5）回收大于10kb的DNA片段時(shí)，BufferEB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱，適當(dāng)延長吸附和洗脫時(shí)間，可增加回收效率。