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用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌注意事項(xiàng)
更新時(shí)間:2015-01-12 點(diǎn)擊量:1620

用超聲波破碎儀破碎大腸桿菌注意事項(xiàng)
用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白,在進(jìn)行超聲波破碎之前,用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,效果較好,1%triton-X-100的作用還是很明顯的,對其他的一些細(xì)菌同樣起作用,比如鏈霉菌。 
細(xì)菌沉淀直接加樣品1 buffer,再加5μl的巰基乙醇,混勻,離心,煮沸10min,直接上樣,染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當(dāng)補(bǔ)點(diǎn)醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min 就可以。在表達(dá)重組蛋白后超聲波破碎細(xì)胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一會就產(chǎn)生大量泡沫,影響了破碎功率, pbs和tris緩沖液都是這樣,zui后都是破碎不*,而我的目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中。
1*會產(chǎn)生氣泡是因?yàn)槟愕奶筋^位置沒放好。超聲波破碎儀探頭一定要接近底部,約1cm(推薦是距底部0.5mm)。功率根據(jù)儀器不同會有所不同,但你可以觀察液面,有波動但不要太劇烈就好。
2*破3s停10s,破碎20-30個(gè)循環(huán)觀察效果。 
3*探頭位置擺放也要注意,聽聲音如果不對的話就要及時(shí)調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。 在超聲波破碎時(shí)試著加大體積,振幅不要超過60%. 
4*嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說,通常方法很難散熱,導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡,停頓時(shí)間稍長一些,這種情況多見于包涵體形式的蛋白。如果換用Branson超聲波破碎儀來進(jìn)行工作,由于熱耗較小,停頓周期可適當(dāng)減小。

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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