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EF44A\J2

苯乙醇胺A

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物苯乙醇胺A將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗苯乙醇胺A抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物苯乙醇胺A的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物苯乙醇胺A的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.1ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時間：       30min～15min

u 樣本檢測下限

尿     樣        ·····························  0.1ppb

組     織        ·····························  0.2ppb

飼     料        ·····························  0.5ppb

u 交叉反應(yīng)率

苯乙醇胺A  ······································ 100%

克倫特羅（Clenbuterol） ························ <1%

沙丁胺醇（Salbutamol ） ·····················  <1%

萊克多巴胺（Ractopamine）···················  <1%

u 樣本回收率

尿     樣    ······························  95%±25%

組織、飼料   ······························  85%±25%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

使用的試劑：乙酸乙酯、冰乙酸、正己烷

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

u 樣本前處理需配置

配液1   樣本提取液：

取99ml乙酸乙酯，加入1ml冰乙酸，混合均勻。

配液2   樣本復(fù)溶液：

將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：2稀釋。

u 樣本處理：

（a）尿樣本處理方法

取20µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

因樣本存在一定干擾，建議以1ppb為樣本陽性 的CUT OFF值。  

（b）組織樣本處理方法

1、 稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g到50ml離心管中；

2、 加入8ml樣本提取液，渦旋震蕩2min；

3、 室溫4000r/min離心10min；

4、 取上層清液2ml于50-60℃吹干；

5、 加入1ml正己烷，再加入1ml樣本復(fù)溶液，渦旋震蕩30秒；

6、 室溫4000r/min離心10min；除去上層有機(jī)相；

7、 取下層清液20µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍

    因樣本存在一定干擾，建議以1ppb為樣本陽性的CUT OFF值。

 （c）飼料樣本處理方法

1、 稱取均質(zhì)后的飼料樣本1±0.05g到50ml離心管中；

2、 加入10ml樣本提取液，渦旋震蕩3min；

3、 室溫4000r/min離心10min；

4、 取上層清液2ml于50-60℃吹干；

5、 加入1ml正己烷，再加入1ml樣本復(fù)溶液，渦旋震蕩30秒；

6、 室溫4000r/min離心10min；除去上層有機(jī)相；

7、 取下層清液20µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  5倍

因樣本存在一定干擾，建議以2ppb為樣本陽性的CUT OFF值。本試劑盒檢測牛尿時回收率偏高。   

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

3、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入80µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干，用稀釋好的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含苯乙醇胺A量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.143； 0.1ppb為1.866；0.3ppb為1.615；0.9ppb為0.964；2.7ppb為0.413；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb；樣本2的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯乙醇胺A實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中苯乙醇胺A實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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