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哺乳動物蛋白抽提試劑盒說明書

Mammalian Protein Extraction Kit

貨號： K0889   

保存：蛋白酶抑制劑混合物：-20℃

   其它 組分：室溫   

組分說明

Catalog no.                     K0889      K0889A

Kit Size                       25  次      100  次

Mammalian Protein Extraction Reagent     25 ml        100 ml

蛋白酶抑制劑混合物                 250  μl       1 ml

產(chǎn)品簡介

      哺乳動物蛋白抽提試劑能夠快速，溫和，高效的裂解哺乳動物細胞，有效提取細胞漿和細胞核蛋白。該試劑使用溫和配方保證所提取蛋白保持生物學活性并可應用于多種蛋白分析試驗，如：報告基因和酶活性測定，免疫檢測，蛋白純化等。提取后蛋白可采用          BCA  法進行蛋白定量分析。哺乳動物蛋白抽提試劑盒中帶有蛋白酶抑制劑混合物，可有效避免蛋白提取過程中蛋白的降解。

注意事項

 1. 本產(chǎn)品可有效裂解細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的貼壁細胞（無需刮?。┮约半x心收集的懸浮細胞，較反復凍融或超聲法具有更高提取效率。但對于組織蛋白的抽提，建議使用組織蛋白抽提試劑（#K0004，#K0891）。

 2. 表一中所列的是貼壁細胞蛋白提取的J使用量，如果需要減少試劑用量從而獲得更高的蛋白濃度，建議首先刮取細胞。

 3. 對于離心獲得的細胞，如果丌知道細胞的體積，可以根據(jù)細胞數(shù)量估計抽提試劑的使用量。如2×10⁶個Hela 細胞約重20 mg，需要加入200μl 抽提試劑，以此類推。

 4. 通過本產(chǎn)品提取的蛋白，可通過BCA法進行蛋白定量分析。

操作步驟        

 ●  貼壁細胞蛋白抽提

 1.  小心傾去貼壁細胞的培養(yǎng)液。

 2.  注意：如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響試驗結(jié)果的物質(zhì)，請先使用PBS漂洗細胞。

 3.  請在蛋白抽提前取出實驗所需蛋白抽提試劑進行預冷， 按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

注意：在進行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

 4.  加入適量哺乳動物蛋白抽提試劑，（在冰上用槍頭吹打貼壁細胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中），冰上孵育20分鐘，讓細胞充分裂解（試劑使用量請參考附表1，冰上放置時間應根據(jù)細胞類型丌同進行調(diào)整）。

 5.  14,000×g離心5-10分鐘。

 6.  轉(zhuǎn)移上清液至新管中，用于進一步分析。

 ●  懸浮細胞蛋白提取

 1. 將懸浮細胞2,500×g，離心10分鐘，棄去上清。

 2. 可選步驟：漂洗。如培養(yǎng)基中含有酚紅或其他可能影響實驗結(jié)果的物質(zhì)，請使用PBS漂洗細胞。

 3. 漂洗后的細胞懸浮液2,500×g，離心10min，棄去上清。

 4. 請在蛋白抽提前取出實驗所需蛋白抽提試劑進行預冷，                             按照1:99比例加入蛋白酶抑制劑混合物（例如990μl抽提試劑中加入10μl蛋白酶抑制劑混合物），使蛋白酶抑制劑混合物在抽提試劑中成1×工作液。

注意：在進行蛋白抽提前2-3分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑混合物。

 5. 加入適量哺乳動物蛋白抽提試劑，每100 mg (~100 µl)細胞至少加入1 ml哺乳動物蛋白抽提試劑。如提取的樣本量較大，可首先使用抽提試劑總使用量的1/10重懸細胞沉淀，然后加入剩余抽提試劑。

 6. 吹打均勻后，冰上放置20分鐘，讓細胞充分裂解（冰上放置時間應根據(jù)細胞類型丌同進行調(diào)整）。                                                 

7. 14,000×g離心15分鐘。

8. 轉(zhuǎn)移上清至新管中，進行下一步分析。

 注：每100 mg細胞約可提取到6 mg的總蛋白（細胞類型丌同略有差異）。                      

參考附表

                                            表  1. 抽提試劑使用量推薦表

細胞培養(yǎng)板類型或平皿類型                     抽提試劑使用量

100 mm                         500-1,000 µl

60 mm                           250-500 µl

6 孔培養(yǎng)板                         200-400 µl /孔

24 孔培養(yǎng)板                         100-200 µl /孔

96 孔培養(yǎng)板                          50-100 µl/孔

* 對于  100 mm  培養(yǎng)板培養(yǎng)的10⁷個細胞  (50 mg)可裂解獲得約3 mg 總蛋白（細胞類型不同略有差異）。            

 2. 常見問題及解決辦法

 1. 低提取率

可能原因：

a低蛋白表達量

b試劑使用量不夠

c試劑無法溶解細胞膜

解決方法：

a優(yōu)化轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

b增加抽提試劑使用量

c增加裂解時間或者加大晃動幅度

2. 無法獲得膜蛋白  

可能原因：用哺乳動物蛋白抽提試劑提取核/漿蛋白  

解決方法：使用真核細胞膜蛋白抽提試劑盒                                                                                                               

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