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超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
測(cè)定意義:
SOD(EC 1.15.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,催化超氧化物陰離子 發(fā)生岐化作用,生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶,也是 H2O2 主要生成 酶,在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
測(cè)定原理:
通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.),O2-.可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜,后者在 560nm 處有吸收;SOD 可清除 O2-.,從而抑制了甲臜的形成;反應(yīng)液藍(lán)色越深, 說(shuō)明 SOD 活性愈低,反之活性越高。
需自備的儀器和用品:
可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:15mL×1 瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存,用時(shí)加入27ml蒸餾水,充分搖勻懸濁液;
試劑三:液體 175μL×1 支,4℃保存;(與蒸餾水1:1稀釋后再使用)
試劑四:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備: 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次); 8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱(chēng)取約 0.1g 組織, 加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
3、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 560nm,蒸餾水調(diào)零。
2、測(cè)定前將試劑一、二和四 37℃(哺乳動(dòng)物)25℃(其他物種)水浴 5min 以上。
3、樣本測(cè)定(在 EP 管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(chēng)(μL) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
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試劑一 | 240 | 240 |
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試劑二 | 510 | 510 |
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試劑三 | 6 | 6 |
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樣本 | 90 |
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試劑四 | 180 | 180 |
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蒸餾水 |
| 90 |
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充分混勻,室溫靜置 30min 后,加入 1mL 玻璃比色皿,560nm 處測(cè)定各管吸光值 A。
注意事項(xiàng):
1、試劑三為酶,不可冷凍,使用時(shí)在冰上放置。
2、對(duì)照管只需要做一管。
SOD 活性計(jì)算:
1、抑制百分率的計(jì)算
抑制百分率=(A 對(duì)照管-A 測(cè)定管) ÷A 對(duì)照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 30-70%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來(lái)的抑制百分率小于 30%或大于 70%,則通常需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏高,則需將樣本用 提取液適當(dāng)稀釋;如果測(cè)定出來(lái)的抑制百分率偏低,則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測(cè)樣本。 2、SOD 酶活性單位:在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時(shí),反應(yīng)體系 中的 SOD 酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。
3、SOD 酶活性計(jì)算:
(1)血清(漿)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷V 樣×樣本稀釋倍數(shù)=11.4×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×樣本稀釋倍數(shù)
(2)組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞 SOD 活力計(jì)算:
a.按樣本蛋白濃度計(jì)算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr)×樣本稀釋倍數(shù)
=11.4×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×樣本稀釋倍數(shù) 需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。
b.按樣本鮮重計(jì)算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)×樣本稀釋 倍數(shù)=11.4×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×樣本稀釋倍數(shù)
c.按細(xì)菌或細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)×樣本稀釋 倍數(shù)=0.0228×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×樣本稀釋倍數(shù)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,1.026mL;V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.09mL;V 樣總: 加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL ;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或 細(xì)菌總數(shù),500 萬(wàn)
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
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