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CCK8檢測的試驗具體內容及注意事項
更新時間:2020-03-24 點擊量:9093
      CCK8檢測的試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】。它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
  一、CCK8檢測的實驗內容:
  取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞,每孔按 4×103個接種至 96 孔板中,每組設置8個復孔,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁后轉染相應質粒后。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后,棄含藥培養(yǎng)基,每孔加入新鮮配制的含 10uL的毒性檢測液CCK8,置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后,用酶標儀測波長為450 nm的OD值。實驗重復 3 次, 取實驗結果的平均值作為實驗結果。按公式計算生長抑制率=[(對照組 OD-實驗組 OD)/對照組 OD]  ×100%,以分組為橫坐標,生長抑制率為縱坐標,繪制細胞生長抑制率柱狀圖。
  當使用標準96孔板時,貼壁細胞的較小接種量至少為1000 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2500 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾,可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
  二、CCK8檢測的注意事項
  CCK8可以檢測大腸桿菌,但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染,以免影響結果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月,在-20℃下避光可以保存1年。當在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時,培養(yǎng)板較外一圈的孔較容易干燥揮發(fā),由于體積不準確而增加誤差。一般情況下,較外一圈的孔只加培養(yǎng)基,不作為測定孔用。在培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時,還應考慮藥物的吸收,可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話,將會100%抑制。懸浮細胞由于染色比較困難,一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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