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總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒說明書
更新時(shí)間:2020-03-09 點(diǎn)擊量:2715

總抗氧化能力(Total antioxidant capacity ,T-AOC)

試劑盒說明書

可見分光光度法

注意:正式測定之前選擇 2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

測定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測血漿、血清、唾液、尿液等各種體液,細(xì)胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液

及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。

測定原理

在酸性環(huán)境下,物質(zhì)還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其總抗氧化能力。

自備實(shí)驗(yàn)用品

可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液:液體 60mL×1 瓶,使用前預(yù)冷。

試劑一:液體 50mL×1 瓶,避光保存。

試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體 5mL×1 瓶,避光保存。

樣品的制備

(1) 血清、血漿、唾液或尿液樣品

血漿(制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝,不宜使用 EDTA 抗凝)4℃,5000rpm 離心10min,取上清待測。血清、唾液或尿液樣品直接用于測定,也可以-80℃凍存(不宜超30 d)后再測定。

(2) 組織樣品

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后 10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

(3) 細(xì)胞樣品

按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)胞加入1mL 提取液),冰浴超聲波破碎(功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

操作步驟

混合液(現(xiàn)配現(xiàn)用):將試劑一、試劑二、試劑三按 10:1:1 的比例混合,使用前預(yù)溫至 37℃ 。

 

空白管

測定管

混合液(μL)

900

900

樣品(μL)

 

30

雙蒸水(μL)

120

90

充分混勻,反應(yīng)10min,雙蒸水調(diào)零,1mL玻璃比色皿,測定593nm處吸光值,△A= A測定

-A空白

注意:空白管只需測定一次。

總抗氧化能力計(jì)算

1. 定義:樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值(△A)所需的標(biāo)準(zhǔn)液離子濃度表示。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.6308 x +0.1291,R2=0.9989

2. 計(jì)算公式:

(1)按蛋白濃度計(jì)算

總抗氧化能力(U/mg prot)=1÷0.6308×(△ A-0.1291)× V 反總÷(V 樣× Cpr)

=53.9×(△ A-0.1291)÷ Cpr

(2)按樣品質(zhì)量計(jì)算

總抗氧化能力(U/g)=1÷0.6308×(△ A-0.1291)× V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)

=53.9×(△ A-0.1291)÷ W

(3)按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

總抗氧化能力(U/104 cell)=1÷0.6308×(△A-0.1291)×V 反總÷V 樣×V 樣總÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))= 53.9×(△A-0.1291)÷ 細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))

(4)按液體體積計(jì)算

總抗氧化能力(U/mL)=1÷0.6308×(△A-0.1291)× V 反總÷V 樣

=53.9×(△A-0.1291)÷ Cpr

V 樣總:加入提取液體積,1 mL; V 反總:反應(yīng)總體積,1.02mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,

0.03mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL

注意事項(xiàng)

1. 試劑二對(duì)人體有刺激性,請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施。為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并

戴乳膠手套操作。

2. 盡量避免使用在酸性條件下呈藍(lán)色或接近藍(lán)色的試劑,否則對(duì)本試劑盒的檢測結(jié)果產(chǎn)生

干擾。

3. 樣品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和 DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反

應(yīng)的還原劑。

4. 如果樣品測定出來的吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以外,需把樣品適當(dāng)稀釋或濃縮后再進(jìn)行測

定。

5. 試劑盒 2-8℃保存。

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