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豬圓環(huán)病毒Ⅱ型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:豬圓環(huán)病毒II型檢測試劑盒(實時熒光PCR法)
英文名稱:Porcine Circovirus II Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,為已知的zui小的動物病毒之一。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測PCV II型,對PCV II型引起的豬的疫病的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對PCVII型基因組高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,在反應(yīng)體系中含PCVII型基因組模板的情況下,PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實時監(jiān)測和輸出,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | 豬圓環(huán)II型 PCR反應(yīng)液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
2 | 豬圓環(huán)II型 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
3 | 豬圓環(huán)II型 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 豬圓環(huán)II型 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注:陰性對照為豬基因組DNA,陽性對照為豬圓環(huán)II型經(jīng)滅活處理的核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 新鮮采集的咽拭子、鼻拭子和糞便標(biāo)本,并使用滅菌生理鹽水懸浮。
2. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃~-80℃。
3. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)(1T)+陽性對照數(shù)(1T)+誤差預(yù)留量(1T)+樣本數(shù)
單反液配制表(每頭份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
混合酶液(Taq酶+UNG酶) | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管和試劑盒中的DNA提取液轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))
用本公司病毒提取試劑盒提取DNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5 μL、終體積25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)管蓋,混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μL/管,蓋好PCR反應(yīng)管蓋,混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR(PCR擴(kuò)增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集PCV II 熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50℃:2分鐘(min) | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 5 | |
55℃:40秒(s) | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結(jié)束時采集熒光信號) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陰性(-) | 標(biāo)本中未檢出豬圓環(huán)II型 |
陽性(+) | 標(biāo)本中檢測出豬圓環(huán)II型 |
【檢驗方法的局限性】
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的zui低檢出限為102 Copies/mL,產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】