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氨芐青霉素酶聯(lián)免疫試劑盒

說明書

一、藥物概述及檢測原理

 氨芐青霉素類抗生素廣譜的抗菌特性，為動(dòng)物疾病的防治提供了、低毒的有力武器，被大量應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。人食用了氨芐青霉素殘留的動(dòng)物源食品會(huì)對(duì)身體造成一定危害甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，所以對(duì)氨芐青霉素殘留的有效監(jiān)測已成為保障食品安全的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

操作流程本公司的氨芐青霉素酶聯(lián)免疫試劑盒使用zui新生物技術(shù)開發(fā)，具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)。

本試劑盒利用氨芐青霉素抗體與氨芐青霉素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和氨芐青霉素抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的氨芐青霉素藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競爭氨芐青霉素抗體，后加入底物催化顯色。此時(shí)顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中氨芐青霉素藥物的含量成反比。

二、試劑盒內(nèi)包含組分：

標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0 ppb、0.5 ppb、1.5 ppb、4.5 ppb、13.5 ppb,500ppb，1 mL/瓶。

96孔酶標(biāo)板：1塊

氨芐青霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）

酶標(biāo)Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）

2×濃縮復(fù)溶液：1瓶（60mL/瓶）

底物A液：1瓶（7 mL/瓶）

底物B液：1瓶（7 mL/瓶）

終止液：1瓶（7mL）

說明書

蓋板膜

自封袋

三、用戶需要自備的設(shè)備和試劑

儀器：

v 酶標(biāo)儀（檢測波長450 nm、630 nm）

v 電子天平（精度：0.01 g）

v 離心機(jī)（4000 g及以上）

v 生化培養(yǎng)箱（可調(diào)25℃）

v 搖床

v 旋渦振蕩器

v 氮吹儀

v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）

v 計(jì)時(shí)器

試劑：

v 乙腈

v 氫氧化鈉

v 正己烷

v 去離子水

四、試劑盒特異性

　　　試劑盒與其他藥物的交叉反應(yīng)率：

v 氨芐青霉素…………………………………100%

五、樣本檢測步驟

1. 工作液準(zhǔn)備

v  0.1M 氫氧化鈉溶液(組織提取用)：稱取0.4g氫氧化鈉加入100ml去離子水溶解混勻。

v 乙腈-0.1M 氫氧化鈉溶液(組織提取用)： 量取84ml乙腈加入16ml 0.1M 氫氧化鈉溶液中，混勻。

v 復(fù)溶工作液：取1份2×濃縮復(fù)溶液加去離子水1份按照1:1的比例稀釋即得。

v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

2. 樣品前處理

組織方法一（雞肉、豬肉、魚、蝦）（稀釋倍數(shù)：4）   

Ø 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

Ø 稱取1±0.05g均質(zhì)后的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中， 加入4ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液（見5.1），用振蕩器振蕩10min，3000g室溫離心10min；

Ø 移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃管中，于60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>

Ø 加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s，溶解干燥殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液（見5.2），用渦旋儀渦動(dòng)30s，充分混勻后轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中，3000g室溫離心5min；

Ø 除去上層有機(jī)相，取下層50μL 用于分析。

Ø 注：批量檢測樣本時(shí)使用本公司代理配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷。

組織方法二（雞肉、豬肉、魚、蝦）（稀釋倍數(shù)：20）   

Ø 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

Ø 稱取1±0.05g均質(zhì)后的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中， 加入4ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液（見5.1），用振蕩器振蕩10min，3000g室溫離心10min；

Ø 移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃管中，于60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?/span>

Ø 加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s，溶解干燥殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液（見5.2），用渦旋儀渦動(dòng)30s，充分混勻后轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中，3000g室溫離心5min；

Ø 除去上層有機(jī)相，取下層水相與復(fù)溶工作液（見5.2）按1：4體積比進(jìn)行稀釋（50μL樣本液+200μL復(fù)溶工作液）；

Ø 取50μL用于分析。

Ø 注：批量檢測樣本時(shí)使用本公司代理配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷。

3. 檢測

Ø 準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測值波動(dòng)建議做雙孔平行實(shí)驗(yàn)（每個(gè)樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)兩孔），未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；

Ø 加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL，向每孔中加入50 μL抗體工作液；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)30 min；

Ø 洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；

Ø 加樣：向每孔中加入100 μL酶標(biāo)二抗工作液；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)30 min；

Ø 洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；

Ø 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；

Ø 孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；

Ø 終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。

Ø 讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標(biāo)板吸光度值。

4. 計(jì)算結(jié)果

Ø 設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比：

Ø 使用半對(duì)數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的吸光度的百分比，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ø 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對(duì)應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測物含量。

六、試劑盒參數(shù)

Ø 試劑盒靈敏度：0.5ppb；

Ø 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.5ppb-13.5ppb；

Ø 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；

Ø 板間變異系數(shù)：<15%；

Ø B0吸光度zui佳值：>0.8；

Ø 回收率：60%±20%

Ø 樣品低檢測限：

　組織方法一……………………………約3ppb

  組織方法二……………………………約10ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限制

本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結(jié)果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實(shí)驗(yàn)（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、試劑盒貯存條件

試劑盒ZUI佳貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。

未使用完的酶標(biāo)板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中。

九、注意事項(xiàng)

使用試劑盒前，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)閱讀說明書。

試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。

試劑在使用前許搖勻，混合時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。

槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復(fù)使用。

請(qǐng)勿使用過期試劑盒，不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用。

樣品處理完畢后請(qǐng)立即分析，否則可能影響檢測結(jié)果。

底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍(lán)色，或混合后立即變藍(lán)，說明試劑已污染或變質(zhì)。

加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時(shí)間差對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請(qǐng)立即用大量清水沖洗。若不慎ru眼，請(qǐng)?jiān)?清洗后去醫(yī)院檢查。